疫苗被認為是針對傳染病的最有效的全球衛(wèi)生干預措施之一，當下和未來的疫苗研發(fā)都面臨著更加有效和多樣化的保護反應以及越來越嚴格的安全系數(shù)的挑戰(zhàn)。開發(fā)新疫苗方法和制劑的主要挑戰(zhàn)是增加有效的免疫激活，導致保護性應答，同時限制過度的炎癥。為了增強免疫反應，研究人員已經(jīng)研究了Toll樣受體激動劑作為疫苗佐劑，因為它們可以激活先天免疫系統(tǒng)，促進多種免疫基因的表達，包括對T細胞重要的炎性細胞因子和細胞表面受體。有效的TLR激動劑可刺激所需的細胞或體液適應性反應，并已成功開發(fā)出幾種疫苗，然而無法直接調(diào)節(jié)炎癥增加了疫苗成本并延緩了其應用?，F(xiàn)在有多種成功的TLR激動劑可用于疫苗，但是新的和高劑量的TLR激動劑面臨的挑戰(zhàn)之一是過度活化或全身分布引起的過度炎癥。

改善佐劑反應是開發(fā)針對某些病原體疫苗的最有希望的途徑，佐劑開發(fā)中的一項最大的挑戰(zhàn)就是調(diào)節(jié)炎癥反應，同時保持免疫激活和保護作用。目前尚無批準具有獨立調(diào)節(jié)炎癥和保護作用能力的佐劑。在這里，研究人員展示了一種增強保護反應同時限制炎癥的方法。為了實現(xiàn)這一目標，研究人員將部分選擇性核因子κB（NF-kB）抑制劑與幾種目前的佐劑聯(lián)合使用，所得疫苗可減輕全身性炎癥并增強保護性反應。研究人員證明了這種方法可以增強保護，并且該方法已在多種佐劑和抗原中進行了測試，不僅可以減少炎癥，還可以增強對流感、HIV等病毒的保護性反應，最終也可以用于開發(fā)新冠疫苗，該項研究成果近日發(fā)表在《Science Advances》上。

檢查CpG誘導的炎癥和產(chǎn)生的免疫反應

研究人員試圖驗證SN50可以使抗原呈遞細胞上調(diào)細胞表面受體，同時限制促炎細胞因子的產(chǎn)生。將小鼠骨髓的來源樹突狀細胞與SN50和CpG或CpG單獨孵育了6小時，并分析了增效劑如何改變細胞因子的產(chǎn)生和細胞表面受體的表達。細胞內(nèi)細胞因子染色顯示，用SN50處理的細胞表現(xiàn)出表達TNF-α和IL-6的細胞明顯減少。同時，CD86表達顯著增加并且CD40表達持續(xù)。因為p65-p50二聚體是在靜息細胞中發(fā)現(xiàn)的最豐富的二聚體，并且參與炎癥細胞因子的產(chǎn)生，所以推測通過抑制該二聚體可以在限制炎癥細胞因子的同時實現(xiàn)細胞表面受體的轉(zhuǎn)錄和翻譯。

在觀察到SN50可以限制炎癥而不降低體外細胞表面受體的表達后，研究人員接下來想在體內(nèi)研究這種作用。為了確定對NF-κB的抑制是否可以降低與CpG疫苗接種相關的促炎細胞因子TNF-α和IL-6的全身水平。在人體中，全身性TNF-α與局部副作用（例如注射部位腫脹和疼痛）相關，全身性IL-6與疫苗接種后的全身系統(tǒng)副作用（例如疲勞和頭痛）相關。此外，這兩種細胞因子在全身分布時均充當熱原，會導致發(fā)燒反應。研究人員在所有組中注射后1、3、6、24和48小時測量了這些促炎細胞因子，以確定響應CpG疫苗接種時細胞因子達到峰值的時間點。為了確定SN50如何影響體液反應研究人員在第28天分析了血清抗體水平，為了廣泛確定SN50的添加如何影響抗體水平使用酶聯(lián)免疫吸附測定來測量總Ig（G + A + M）。與單獨的PBS相比，CpG組的抗OVA抗體增加了2.4倍。接種了CpG + SN50的小鼠比PBS組增加了5.9倍，而CpG組增加了2.7倍。這些數(shù)據(jù)證實了添加SN50會增強下游的適應性反應，從而導致免疫增強。由于疫苗接種后適應性反應的增加和耐受性的改善，研究人員將SN50歸類為免疫增強劑。

體內(nèi)流感激發(fā)模型的免疫增強

接下來研究人員將重點關注SN50如何過渡到具有病毒挑戰(zhàn)的疫苗。研究人員選擇流感疫苗作為概念驗證疫苗，是因為它具有通用性，并且相對容易操作。研究人員試圖確定SN50是否會減少與強佐劑相關的副作用，并觀察這種改變對全身細胞因子的保護作用。研究人員在2017/2018流感季節(jié)使用Fluzone四價疫苗注射給小鼠，有無CpG（50μg）作為免疫佐劑，有500μgSN50（SN50H或50μgSN50（SN50 L）作為免疫佐劑免疫增強劑。Fz + SN50組的TNF-α水平低于單獨Fz。在所有組中，添加SN50可使TNF-α和IL-6的水平降低至與安慰劑組一致的水平。為了檢查SN50是否可以減輕接種疫苗的副作用，研究人員分析了接種后24、48和72小時的體重變化百分比。體重減輕是小鼠副作用最客觀的度量，到24小時時，接種Fz和Fz + SN50的小鼠平均損失0.85和0.75％，F(xiàn)z + CpG組平均損失5.9％。在第72小時，F(xiàn)z組的體重為起始體重的-1.1％，而接種Fz + SN50的小鼠體重增加了+ 1.5％。Fz + CpG組的體重減輕了起始重量的-1.6％，添加SN50 H導致體重減輕（變化0％），添加SN50 L導致體重減輕了-1.3％?？傮w而言，具有SN50的小鼠比沒有SN50的小鼠體重減輕得更少，這表明SN50降低了與疫苗接種相關的副作用，并提高了疫苗的耐受性。

在第28天，研究人員分析了血清中血液中的抗體水平，F(xiàn)z和Fz+ SN50之間的血清IgG濃度無顯著差異，F(xiàn)z樣品和Fz+CpG之間有2.9倍的顯著差異。接種CpG的組之間無顯著差異，這表明添加SN50可以減輕炎癥和疫苗接種的副作用，提高耐受性，同時保持抗體濃度。接下來，研究人員試圖確定在疫苗中加入SN50是否會增強對Fluzone的保護。在此階段沒有對小鼠施用任何額外的SN50，因此只有疫苗誘導的適應性免疫反應和隨后的加強免疫可以起到保護小鼠免受流感的作用。在Fz+CpG中添加SN50可提供同等的保護，同時可改善初次接種疫苗的副作用和耐受性，在Fz中添加SN50可提供等同于Fz+CpG組的增強保護。這表明SN50除了提高耐受性外，還可以增強疫苗的適應性免疫潛能。

新疫苗佐劑的耐受性和保護性通常被認為是兩個具有反比關系的相互依賴的變量，其中通過限制耐受性獲得了足夠的保護，反之亦然。由于這種增強劑使疫苗既安全又更具保護性，研究人員想要尋求一種單一方法來分析SN50如何改變耐受性和保護性。由于這些變量被認為是負相關的，因此很少有相關的先例。遵循評分系統(tǒng)的先例，研究人員開發(fā)了一個容忍度與保護度的關系圖，該圖僅用作本研究中收集的所有數(shù)據(jù)的直觀表示。在疫苗接種中包括SN50的所有組均增加了耐受性和疫苗保護性。綜合所有數(shù)據(jù)后得出結論，SN50通過增加耐受性和改善疫苗接種的保護效果而充當免疫增強劑。

改善各種TLR和物種的佐劑反應

為了檢查SN50在各種TLR激動劑中的作用，研究人員對用SN50處理的RAW巨噬細胞進行了定量聚合酶鏈反應，然后用不同TLR的激動劑進行刺激。用SN50和脂多糖（LPS;10ng/ml）、CpG（5μg/ ml）、R848（1μg/ml）和Pam3CSK4（100ng/ml）刺激細胞，并將轉(zhuǎn)錄水平與TLR激動劑處理的細胞進行比較單獨使用。在RAW巨噬細胞中，研究人員觀察到TNF-α和IL-6的下調(diào)促炎細胞因子轉(zhuǎn)錄水平。與單獨的激動劑相比，在所有激動劑中細胞表面受體CD86和MHCII轉(zhuǎn)錄水平均被上調(diào)。這與體內(nèi)觀察結果相吻合，當在SN50與CpG一起使用時，淋巴結內(nèi)cd86表達增加并且細胞活性增加，這表明增加T細胞反應和增加與T細胞中細胞遷移和細胞毒性相關的基因表達的相同作用對于大多數(shù)佐劑將維持不變。

為了檢查其在體內(nèi)的翻譯方式，研究人員使用gp120作為抗原為小鼠接種了CpG（50μg）、Pam3CSK4（20μg）和R848（50μg），將這些佐劑與最廣泛使用的明礬（250μg）一起使用。使用CpG觀察到完全消除了全身性TNF-α和IL-6促炎細胞因子，使用R848和Pam3CSK4發(fā)現(xiàn)TNF-α和IL-6均顯著降低。僅明礬不會引起全身性細胞因子應答，并且添加SN50不會改變細胞因子譜。這些數(shù)據(jù)表明，SN50在廣泛的佐劑上可用于減輕全身性炎癥，同時維持提高適應性反應，這證明了該系統(tǒng)對大量免疫佐劑具有廣泛的潛在用途。

為了了解這種效果如何轉(zhuǎn)化為人類疫苗，研究人員用含或不含SN50的LPS（1μg/ ml）處理了THP-1單核細胞。用SN50和LPS處理的細胞表達的TNF-α和IL-6水平明顯降低，還觀察到CD40和CD86的水平增加。用SN50和LPS或單獨的LPS刺激了NHP PBMC 6小時，并分析了細胞上清液中的促炎細胞因子，用LPS刺激的細胞在細胞上清液中顯示出高水平的TNF-α和IL-6，而具有SN50的細胞則顯示出細胞因子水平的顯著降低。因此與單獨用LPS刺激的細胞相比，用SN50和LPS刺激的細胞中CD86表達增加了兩倍，這意味著SN50在NHP和人類中的作用可能與在小鼠中的相似。